熒光物質(zhì)會吸收物質(zhì)固有波長的光，而發(fā)射出較長波長的熒光。熒光物質(zhì)吸光后發(fā)射的熒光光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光光子數(shù)的比值被稱為熒光量子效率。其與熒光物質(zhì)的熒光強度有關(guān)。 熒光量子效率采用絕對法測定的方式，是對積分球測定得到的熒光物質(zhì)的熒光光譜直接進行計算的方法。熒光量子產(chǎn)率采用相對法測定的方式，將樣品的熒光強度與已知標準熒光物質(zhì)強度進行比較的計算方法。由于絕對法僅對目標熒光物質(zhì)進行計算，因而比相對法更加簡便。

本文向您介紹使用熒光分光光度計RF-6000 和積分球附件，計算熒光量子效率的方法和對硫酸奎寧進行測定的示例

熒光量子效率的計算方法 ：

圖1 為用于測定熒光效率的熒光光譜儀RF-6000；圖2 為熒光量子效率計算方法的模式圖。由圖可知，在計算熒光量子效率時，首先測定空白樣品（液體樣品時為溶劑）的熒光光譜，接著測定樣品的熒光光譜，上述光譜必須為經(jīng)過儀器校正后的熒光光譜。通過以往的舊機型很難簡便地得到校正后的熒光光譜，但RF-6000能夠得到自動校正的熒光光譜，因此可以快速計算熒光量子效率。 與熒光量子效率相關(guān)的量有吸收率、內(nèi)量子效率和外量子效率。表1 為各定義式。由表可知，吸收率為照射在樣品中的光子數(shù)被吸收的比例。內(nèi)量子效率為吸收的光子數(shù)中被作為熒光發(fā)射的光子數(shù)的比例。外量子效率為照射的光子數(shù)中被作為熒光發(fā)射的光子數(shù)的比例。按照圖2 中①、②、③、④區(qū)域的積分面積值計算上述各數(shù)值。由此可知，熒光量子效率與內(nèi)量子效率對應(yīng)。 RF-6000 的標準軟件LabSolutions RF 可以計算吸收率、內(nèi)量子效率（熒光量子效率）、外量子效率的所有量

測定硫酸奎寧的熒光量子效率 使用硫酸奎寧二水合物（和光純藥工業(yè)株式會社制造，特級試劑），制備200 mg/L 的硫酸奎寧溶液（溶劑：1.0 N 硫酸）。 硫酸奎寧的熒光量子效率的計算步驟如下：

① 將積分球安裝到RF-6000 的樣品室中。

② 如圖3 所示，將裝有空白樣品（溶劑：1.0 N 硫酸）的熒光比色皿放置到積分球內(nèi)的池架內(nèi)，關(guān)閉積分球。

③ 通過LabSolutions RF“量子效率”測定程序測定空白樣品的熒光光譜。然后替換為裝有硫酸奎寧溶液的比色皿，測定熒光光譜。如圖3 所示，激發(fā)光經(jīng)過積分球入射窗口照射在樣品上，發(fā)射出熒光，此時積分球內(nèi)還存在激發(fā)光的散射光。其中部分熒光從積分球出射窗口進入熒光分光器中，從而得到熒光光譜。

④ 按照已設(shè)波長范圍計算空白樣品和硫酸奎寧溶液的峰面積。使用表1 的公式計算AF（吸收率）、QEin（內(nèi)量子效率）和QEex（外量子效率），如圖4 所示。計算時使用的波長范圍可以通過移動圖5 所示的兩根豎線任意設(shè)定。

本次分析中，根據(jù)圖5 中藍色箭頭所示的320 nm～370 nm 的波長范圍計算了圖2 的①、③峰面積；根據(jù)綠色箭頭所示370 nm～680 nm 的波長范圍計算了②、④的峰面積。由此得到的硫酸奎寧熒光量子效率為0.5336，符合文獻值1）規(guī)定的范圍（0.50～0.57）

綜上所述，通過RF-6000 的自動光譜校正功能，能夠輕松地得到熒光量子效率測定所需的校正后熒光光譜。使用積分球附件和標準軟件LabSolutions RF，則能夠簡便地得到目標物質(zhì)的熒光量子效率。